目的探討宮頸癌細胞乳脂肪球表皮生長因子8蛋白(MFGE8)表達與生物學行為的相關性。方法Si-Ha細胞分為三組:對照組、實驗1組與實驗2組，對照組不進行轉染，實驗1組與實驗2組分別轉染siＲNA1-MFGE8與siＲNA2-MFGE8，采用實時熒光定量PCＲ檢測MFGE8mＲNA表達，Westernblot檢測MFGE8蛋白表達，CCK-8法檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞周期與細胞凋亡。結果轉染24h與48h后，實驗1組與實驗2組的MFGE8mＲNA與蛋白相對表達水平、細胞增殖指數都低于對照組(P＜0．05)，細胞凋亡指數顯著高于對照組(P＜0．05)，實驗1組與實驗2組之間對比差異無統計學意義(P＞0．05)。轉染后48h，三組的細胞G1、S、G2/M期對比差異都無統計學意義(P＞0．05)。結論宮頸癌細胞中MFGE8表達呈現高表達情況，抑制MFGE8能抑制宮頸癌細胞的增殖，促進其凋亡，但是對細胞周期無顯著影響。

　　【關鍵詞】宮頸癌;乳脂肪球表皮生長因子8蛋白;生物學行為;相關性

　　宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，宮頸癌在我國的發病率逐年增加，嚴重威脅女性的身心健康［1］。高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavims，HPV)的持續感染是宮頸癌的主要誘發因素，至少80%左右的宮頸癌患者在病程進展中存在生殖器HPV感染［2-3］。乳脂肪球表皮生長因子8蛋白(milkfatglobuleEGFfactor8，MFGE8)作為1種分泌性糖蛋白，在巨噬細胞、內皮細胞、肌上皮細胞、樹突狀細胞等都有廣泛分布［4］。MFGE8在腫瘤組織中表達明顯高于正常組織，其表達分布與病程長短密切相關，可能成為判斷腫瘤患者預后的特異性指標［5-7］，但是在宮頸癌中的應用還無相關報道。本文具體探討了宮頸癌細胞MFGE8表達與生物學行為的相關性，希望可豐富對宮頸癌致癌分子機制的認識，并為發現宮頸癌治療的新靶點提供一定的基礎。現報告如下。

　　1材料與方法

　　1．1實驗材料SiHa細胞株由本實驗室保存，其為宮頸癌HPV16陽性的鱗癌細胞，培養條件:10%胎牛血清(美國Hy-Clone公司)+DMEM培養基(美國HyClone公司)，37℃、5%培養箱。0．25%胰酶消化液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發光試劑購自上海碧云天生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司。1．2實驗分組與處理根據NCBI數據庫中MFGE8基因的序列設計si-siＲNA-MFGE8序列兩條，交由上海吉瑪公司合成。siＲNA1-MFGE8:5＇-ACAGAACACUCAUGGAUUATT-3＇(正鏈)，5＇-UAAUCCAUGAGUGUUCUGUTT-3＇(負鏈);siＲNA2-MFGE8:5＇-CGAGCACAAACGGAAACAATT-3＇(正鏈)，5＇-UUGUUUCCGUUUGUGCUCGTT-3＇(負鏈)。SiHa細胞分為3組:對照組、實驗1組與實驗2組，對照組不進行轉染，實驗1組與實驗2組分別轉染siＲNA1-MFGE8與siＲNA2-MFGE8。在轉染過程中，配制細胞轉染混合液，在6孔板(對數生長期且細胞狀態良好的SiHa細胞)相應孔內依次加入500μl無血清培養基，5μlsi-ＲNA轉染試劑Lipofectamine�LＲNAiMAX，混勻靜置5min后再加入2μlsi-ＲNA，在混勻靜置20min。將細胞懸液按滴加入各孔，然后常規進行培養，培養6h后進行換液。1．3實時熒光定量PCＲ檢測MFGE8mＲNA表達使用TaKaＲaSYBＲPremix試劑進行實時熒光定量PCＲ反應，配置體系:2×mix5．0μl，正鏈引物0．5μl，負鏈引物0．5μl，模板2．0μl，滅菌水6．5μl，將混合液加入實時熒光定量PCＲ8連排管中，每個樣品設置3個復孔。1．4Westernblot檢測MFGE8蛋白表達胰蛋白酶消化處于對數生長期的細胞，收集細胞，加入預冷的ＲIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃，12000rpm，離心15min，取上清，即細胞總蛋白。使用BCA法測定蛋白濃度，然后上樣SDS-PAGE膠進行電泳，電泳后進行轉膜，室溫封閉3h后加入抗MFGE8抗體與抗β-actin抗體各2μl(一抗稀釋濃度1∶1000)，4℃過夜;洗膜后加入二抗(稀釋濃度1∶10000)2μl，室溫1h，然后進行ECL曝光，記錄MF-GE8蛋白相對表達水平。1．5CCK-8法檢測細胞增殖能力胰蛋白酶消化細胞并接種于96孔板中，每孔細胞數量大約為3000～4000個，每組細胞設置3個復孔。培養48h后向每孔加入10μlCCK-8工作液，振蕩混勻后繼續培養2h，使用酶標儀測定450nm處的吸光光度值，記錄與計算細胞增殖指數。1．6流式細胞術檢測細胞周期與細胞凋亡胰蛋白酶消化細胞并收集細胞，采用用100μl預冷的PBS重懸細胞，再加入500μl預冷的75%乙醇固定細胞，4℃放置12h后采用流式細胞術檢測細胞周期。在細胞凋亡檢測中，用400μl1×AnnexinV結合液懸浮細胞，加入5μlAnnexinV-FITC染色體，混勻后4℃避光條件下孵育15min，加入10μlPI染色液后輕輕混勻于4℃避光孵育5min，采用流式細胞術檢測細胞凋亡指數。上述所有實驗都重復3次，取3次檢測的平均值。1．7統計方法應用SPSS22．00軟件進行數據分析，計量數據以(x珋±s)表示，兩兩對比采用t檢驗、LSD方法，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準為α=0．05，P＜0．05為存在統計學差異。

　　2結果

　　2．1MFGE8mＲNA與蛋白表達水平對比轉染24h與48h后，與對照組相比，實驗1組與實驗2組的MFGE8mＲNA與蛋白相對表達水平都顯著降低(P＜0．05)，實驗1組與實驗2組之間對比差異無統計學意義(P＞0．05)。見表1。2．2細胞增殖指數對比轉染24h與48h后，實驗1組與實驗2組的細胞增殖指數顯著低于對照組(P＜0．05)，實驗1組與實驗2組之間對比差異無統計學意義(P＞0．05)。見表2。2．3細胞凋亡指數對比轉染24h與48h后，實驗1組與實驗2組的細胞凋亡指數顯著高于對照組(P＜0．05)，實驗1組與實驗2組之間對比差異無統計學意義(P＞0．05)，見表3。2．4細胞周期對比轉染后48h，三組的細胞G1、S、G2/M期對比差異都無統計學意義(P＞0．05)，見表4。

　　3討論

　　宮頸癌是由于宮頸細胞的增生異常引起的惡性腫瘤，當前在我國年輕女性中的發病人數逐年增加，嚴重威脅著女性的生命和健康［8］。該病在發生發展過程中多伴隨有異常的陰道出血、骨盆疼痛等癥狀，嚴重情況下可出現下腹部劇烈疼痛，導致無法下地行走等［9］。該病的高危因素比較多，包括機體免疫系統功能低下、HPV病毒感染、吸煙、長期使用避孕藥等［10-11］。雖然HPV多價疫苗能夠有效預防宮頸癌的發生，但是在臨床上的普及仍存在很大問題，為此早期分析宮頸癌的發生機制具有重要價值［12］。MFGE8是1種存在于多種物種乳汁脂肪小球表面的親脂性糖蛋白，主要由膽固醇、磷脂、糖蛋白、蛋白脂構成，主要由分化的乳腺上皮細胞合成，然后經膜包被分泌人乳導管腔［13］。MFGE8在乳腺癌細胞中發現MFGE8的分泌量顯著提高，可通過辨認暴露于凋亡上皮細胞表面的絲氨酸與凋亡的上皮細胞結，從而加快對凋亡細胞的清除［14］。MFGE8在惡性腫瘤的高表達還可抑制病毒的表達，促進凋亡上皮細胞的清除，從而促進腫瘤細胞的快速增殖與轉移［15］。本研究顯示轉染24h與48h后，實驗1組與實驗2組的細胞增殖指數顯著低于對照組，細胞凋亡指數顯著高于對照組，實驗1組與實驗2組之間對比差異無統計學意義，表明抑制MFGE8的表達能抑制宮頸癌細胞增殖與促進細胞凋亡。從機制上分析，MFGE8可以通過調節NF-kB、P53等多種轉錄因子與DNA的結合能力，加快血管內皮生長因子的表達量，從而促進腫瘤細胞快速增長［16］。并且MFGE8可通過促使DNA前體合成、抑制由細胞黏附促發的應激信號等多種途徑促進腫瘤細胞的增殖及生長［17］。當前在臨床上主要采取手術、放療和化療等手段對宮頸癌進行治療，但是很難持續改善患者的預后［18］。而無論是抑癌基因還是癌基因，均是細胞中的正常基因，二者共同調控細胞的分化、凋亡、周期、增殖等生物學行為，當癌基因過度表達或者抑癌基因表達被抑制，都會導致細胞的異常增殖與分化，也會導致細胞周期失控［19］。本研究顯示轉染后48h，三組的細胞G1、S、G2/M期對比差異都無統計學意義，表明抑制MFGE8的表達對宮頸癌細胞的細胞周期無顯著影響。當前有研究顯示MFGE8的高表達通過結合腫瘤細胞膜上磷脂酰絲氨酸，促進細胞向前移動爬行，導致細胞的形態及骨架結構發生改變，從而加速細胞的侵襲，并且還通過增強對抗癌藥物的耐藥作用影響患者的預后［20］。并且MFGE8還可激活巨噬細胞和T淋巴細胞，改變胰島素敏感性，導致胰島素抵抗，促進惡性腫瘤細胞的增殖［21］。不過MFGE8在宮頸癌中的作用有一定的復雜性，在某種意義上細胞學實驗無法真實反映出MFGE8的表達譜，可能存在一定的研究偏倚，將在下一步進行深入分析。總之，宮頸癌細胞中MFGE8表達呈現高表達情況，抑制MFGE8能抑制宮頸癌細胞的增殖，促進其凋亡，但是對細胞周期無顯著影響。

　　作者：杜嵐 安旭琢 史欣 楊瑾 王