目的探討宮頸癌細(xì)胞乳脂肪球表皮生長因子8蛋白(MFGE8)表達(dá)與生物學(xué)行為的相關(guān)性。方法Si-Ha細(xì)胞分為三組:對照組、實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組，對照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組分別轉(zhuǎn)染siＲNA1-MFGE8與siＲNA2-MFGE8，采用實(shí)時熒光定量PCＲ檢測MFGE8mＲNA表達(dá)，Westernblot檢測MFGE8蛋白表達(dá)，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡。結(jié)果轉(zhuǎn)染24h與48h后，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組的MFGE8mＲNA與蛋白相對表達(dá)水平、細(xì)胞增殖指數(shù)都低于對照組(P＜0．05)，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P＜0．05)，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組之間對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。轉(zhuǎn)染后48h，三組的細(xì)胞G1、S、G2/M期對比差異都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。結(jié)論宮頸癌細(xì)胞中MFGE8表達(dá)呈現(xiàn)高表達(dá)情況，抑制MFGE8能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，但是對細(xì)胞周期無顯著影響。

　　【關(guān)鍵詞】宮頸癌;乳脂肪球表皮生長因子8蛋白;生物學(xué)行為;相關(guān)性

　　宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，宮頸癌在我國的發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重威脅女性的身心健康［1］。高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavims，HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌的主要誘發(fā)因素，至少80%左右的宮頸癌患者在病程進(jìn)展中存在生殖器HPV感染［2-3］。乳脂肪球表皮生長因子8蛋白(milkfatglobuleEGFfactor8，MFGE8)作為1種分泌性糖蛋白，在巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等都有廣泛分布［4］。MFGE8在腫瘤組織中表達(dá)明顯高于正常組織，其表達(dá)分布與病程長短密切相關(guān)，可能成為判斷腫瘤患者預(yù)后的特異性指標(biāo)［5-7］，但是在宮頸癌中的應(yīng)用還無相關(guān)報道。本文具體探討了宮頸癌細(xì)胞MFGE8表達(dá)與生物學(xué)行為的相關(guān)性，希望可豐富對宮頸癌致癌分子機(jī)制的認(rèn)識，并為發(fā)現(xiàn)宮頸癌治療的新靶點(diǎn)提供一定的基礎(chǔ)。現(xiàn)報告如下。

　　1材料與方法

　　1．1實(shí)驗(yàn)材料SiHa細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存，其為宮頸癌HPV16陽性的鱗癌細(xì)胞，培養(yǎng)條件:10%胎牛血清(美國Hy-Clone公司)+DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，37℃、5%培養(yǎng)箱。0．25%胰酶消化液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。1．2實(shí)驗(yàn)分組與處理根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中MFGE8基因的序列設(shè)計(jì)si-siＲNA-MFGE8序列兩條，交由上海吉瑪公司合成。siＲNA1-MFGE8:5＇-ACAGAACACUCAUGGAUUATT-3＇(正鏈)，5＇-UAAUCCAUGAGUGUUCUGUTT-3＇(負(fù)鏈);siＲNA2-MFGE8:5＇-CGAGCACAAACGGAAACAATT-3＇(正鏈)，5＇-UUGUUUCCGUUUGUGCUCGTT-3＇(負(fù)鏈)。SiHa細(xì)胞分為3組:對照組、實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組，對照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組分別轉(zhuǎn)染siＲNA1-MFGE8與siＲNA2-MFGE8。在轉(zhuǎn)染過程中，配制細(xì)胞轉(zhuǎn)染混合液，在6孔板(對數(shù)生長期且細(xì)胞狀態(tài)良好的SiHa細(xì)胞)相應(yīng)孔內(nèi)依次加入500μl無血清培養(yǎng)基，5μlsi-ＲNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine�LＲNAiMAX，混勻靜置5min后再加入2μlsi-ＲNA，在混勻靜置20min。將細(xì)胞懸液按滴加入各孔，然后常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)6h后進(jìn)行換液。1．3實(shí)時熒光定量PCＲ檢測MFGE8mＲNA表達(dá)使用TaKaＲaSYBＲPremix試劑進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCＲ反應(yīng)，配置體系:2×mix5．0μl，正鏈引物0．5μl，負(fù)鏈引物0．5μl，模板2．0μl，滅菌水6．5μl，將混合液加入實(shí)時熒光定量PCＲ8連排管中，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。1．4Westernblot檢測MFGE8蛋白表達(dá)胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的ＲIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃，12000rpm，離心15min，取上清，即細(xì)胞總蛋白。使用BCA法測定蛋白濃度，然后上樣SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，室溫封閉3h后加入抗MFGE8抗體與抗β-actin抗體各2μl(一抗稀釋濃度1∶1000)，4℃過夜;洗膜后加入二抗(稀釋濃度1∶10000)2μl，室溫1h，然后進(jìn)行ECL曝光，記錄MF-GE8蛋白相對表達(dá)水平。1．5CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力胰蛋白酶消化細(xì)胞并接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量大約為3000～4000個，每組細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)48h后向每孔加入10μlCCK-8工作液，振蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2h，使用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光光度值，記錄與計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。1．6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集細(xì)胞，采用用100μl預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再加入500μl預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞，4℃放置12h后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。在細(xì)胞凋亡檢測中，用400μl1×AnnexinV結(jié)合液懸浮細(xì)胞，加入5μlAnnexinV-FITC染色體，混勻后4℃避光條件下孵育15min，加入10μlPI染色液后輕輕混勻于4℃避光孵育5min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)。上述所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次，取3次檢測的平均值。1．7統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS22．00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以(x珋±s)表示，兩兩對比采用t檢驗(yàn)、LSD方法，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0．05，P＜0．05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

　　2結(jié)果

　　2．1MFGE8mＲNA與蛋白表達(dá)水平對比轉(zhuǎn)染24h與48h后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組的MFGE8mＲNA與蛋白相對表達(dá)水平都顯著降低(P＜0．05)，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組之間對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見表1。2．2細(xì)胞增殖指數(shù)對比轉(zhuǎn)染24h與48h后，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組的細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于對照組(P＜0．05)，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組之間對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見表2。2．3細(xì)胞凋亡指數(shù)對比轉(zhuǎn)染24h與48h后，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組的細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P＜0．05)，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組之間對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見表3。2．4細(xì)胞周期對比轉(zhuǎn)染后48h，三組的細(xì)胞G1、S、G2/M期對比差異都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見表4。

　　3討論

　　宮頸癌是由于宮頸細(xì)胞的增生異常引起的惡性腫瘤，當(dāng)前在我國年輕女性中的發(fā)病人數(shù)逐年增加，嚴(yán)重威脅著女性的生命和健康［8］。該病在發(fā)生發(fā)展過程中多伴隨有異常的陰道出血、骨盆疼痛等癥狀，嚴(yán)重情況下可出現(xiàn)下腹部劇烈疼痛，導(dǎo)致無法下地行走等［9］。該病的高危因素比較多，包括機(jī)體免疫系統(tǒng)功能低下、HPV病毒感染、吸煙、長期使用避孕藥等［10-11］。雖然HPV多價疫苗能夠有效預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，但是在臨床上的普及仍存在很大問題，為此早期分析宮頸癌的發(fā)生機(jī)制具有重要價值［12］。MFGE8是1種存在于多種物種乳汁脂肪小球表面的親脂性糖蛋白，主要由膽固醇、磷脂、糖蛋白、蛋白脂構(gòu)成，主要由分化的乳腺上皮細(xì)胞合成，然后經(jīng)膜包被分泌人乳導(dǎo)管腔［13］。MFGE8在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MFGE8的分泌量顯著提高，可通過辨認(rèn)暴露于凋亡上皮細(xì)胞表面的絲氨酸與凋亡的上皮細(xì)胞結(jié)，從而加快對凋亡細(xì)胞的清除［14］。MFGE8在惡性腫瘤的高表達(dá)還可抑制病毒的表達(dá)，促進(jìn)凋亡上皮細(xì)胞的清除，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速增殖與轉(zhuǎn)移［15］。本研究顯示轉(zhuǎn)染24h與48h后，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組的細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于對照組，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組之間對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抑制MFGE8的表達(dá)能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖與促進(jìn)細(xì)胞凋亡。從機(jī)制上分析，MFGE8可以通過調(diào)節(jié)NF-kB、P53等多種轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力，加快血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)量，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞快速增長［16］。并且MFGE8可通過促使DNA前體合成、抑制由細(xì)胞黏附促發(fā)的應(yīng)激信號等多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及生長［17］。當(dāng)前在臨床上主要采取手術(shù)、放療和化療等手段對宮頸癌進(jìn)行治療，但是很難持續(xù)改善患者的預(yù)后［18］。而無論是抑癌基因還是癌基因，均是細(xì)胞中的正常基因，二者共同調(diào)控細(xì)胞的分化、凋亡、周期、增殖等生物學(xué)行為，當(dāng)癌基因過度表達(dá)或者抑癌基因表達(dá)被抑制，都會導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖與分化，也會導(dǎo)致細(xì)胞周期失控［19］。本研究顯示轉(zhuǎn)染后48h，三組的細(xì)胞G1、S、G2/M期對比差異都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抑制MFGE8的表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期無顯著影響。當(dāng)前有研究顯示MFGE8的高表達(dá)通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸，促進(jìn)細(xì)胞向前移動爬行，導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)及骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而加速細(xì)胞的侵襲，并且還通過增強(qiáng)對抗癌藥物的耐藥作用影響患者的預(yù)后［20］。并且MFGE8還可激活巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，改變胰島素敏感性，導(dǎo)致胰島素抵抗，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖［21］。不過MFGE8在宮頸癌中的作用有一定的復(fù)雜性，在某種意義上細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)無法真實(shí)反映出MFGE8的表達(dá)譜，可能存在一定的研究偏倚，將在下一步進(jìn)行深入分析。總之，宮頸癌細(xì)胞中MFGE8表達(dá)呈現(xiàn)高表達(dá)情況，抑制MFGE8能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，但是對細(xì)胞周期無顯著影響。

　　作者：杜嵐 安旭琢 史欣 楊瑾 王