據統計，目前約有46%～64%的糖尿病患者罹患糖尿病性角膜病變。隨著糖尿病患病率的日益攀升，糖尿病性角膜病變逐漸受到眼科醫生的重視，但其發病機制尚未明確。氧化應激是機體內活性氧和活性氮產生過多，從而損害機體組織細胞的一種病理過程，其參與眾多疾病的發生發展，在糖尿病眼部并發癥中亦扮演重要角色。本文回顧氧化應激在糖尿病性角膜病變發病機制以及治療中的研究進展，希望對臨床診療有所助益。

　　關鍵詞:糖尿病性角膜病變;氧化應激;發病機制;研究進展

　　0引言

　　根據國際糖尿病聯盟(IDF)的最新統計，全球現有約4．64億糖尿病(diabetesmellitus，DM)患者，患病人數約占全球成年人口的9．3%，其中中國約有1．164億患者，數量位居世界第一［1］。以糖尿病視網膜病變、并發性白內障、糖尿病性角膜病變(diabetickeratopathy，DK)為代表的DM眼部并發癥嚴重影響患者視力，降低患者生活水平，是眼科醫生一直較為關注的領域。氧化應激(oxidativestress，OS)是指細胞內促氧化和抗氧化平衡失調，導致氧化作用增強的一種氧化還原狀態，它參與眾多疾病的發生發展。OS在DM眼部并發癥的作用既往已有較多研究，但主要集中在糖尿病視網膜病變，隨著DK發病率上升日益受到重視，OS反應在DK中的作用愈顯重要，本文對此項研究進行綜述。

　　1DK的病理表現和發病機制

　　DK一般表現為眼部外傷或術后持續性角膜上皮缺損、愈合延遲、淺層點狀角膜炎，逐步發展為角膜潰瘍［2］，而這些體征均源于高糖對角膜各層組織細胞的損害。其病理表現主要包括［3－4］:(1)上皮細胞增殖和遷移受到影響，細胞間的黏附下降;(2)上皮基底膜增厚，其間的半橋粒數目減少伴有晚期糖基化終末產物(advancedglycationendproducts，AGEs)的沉積;(3)角膜基質中的錨原纖維組織減少，導致其與基底膜之間的連結變松;(4)角膜內皮細胞密度降低，形態異常;(5)角膜基底神經叢纖維長度變短、纖維密度以及分支數量均減少。DK的發病機制主要包括三大類:(1)糖基化終末產物的沉積;(2)有關上皮修復信號通路活化的抑制;(3)氧化應激反應。這三類分子機制并非獨立參與DK的發生，而是共同作用進而導致細胞凋亡、細胞壞死、激發炎癥反應，最終損害角膜。

　　2OS與DM

　　OS是指活性氧(reactiveoxygenspecices，ＲOS)和活性氮(reactivenitrogenspecices，ＲNS)的產生與機體內抗氧化防御系統的清除相失衡，造成ＲOS和ＲNS過多，進而對機體組織細胞產生損害。有研究證明［5］免疫細胞在病原體防御中發揮吞噬作用時，ＲOS起著至關重要的作用，這說明輕度OS對機體新陳代謝有積極影響，產生了一定的保護作用。然而ＲOS、ＲNS的產生與機體內抗氧化防御系統的清除平衡一旦被打破，過量的ＲOS不僅會損傷組織細胞的核酸、蛋白質等生物大分子，還會引起機體代謝途徑異常，導致一系列疾病的發生。既往研究表明［6－7］，OS與癌癥、帕金森病、阿爾茨海默癥、動脈粥樣硬化、心力衰竭等多種疾病的發生發展有關，同時也在DM相關并發癥中起重要作用。DM患者血液中持續的高血糖水平會通過增加線粒體氧耗量損傷線粒體功能，導致線粒體功能障礙，還因激活NADH/NADPH氧化酶從而上調ＲOS水平，同時增強一氧化氮合酶(NOS)活性導致一氧化碳(NO)合成增加以及抗氧化劑(例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和多種維生素)表達降低，進而導致機體組織細胞氧化還原狀態失衡［8－11］。

　　3OS與DK

　　DK的發病是一個復雜的過程，而OS貫穿其中。慢性的高糖狀態會從多個方面影響角膜組織細胞包括角膜神經的正常生理狀態。例如AGEs的沉積、炎性反應激活、線粒體功能障礙等，然而這多個途徑最終匯集于一點及ＲOS/ＲNS的增多及OS反應，OS會引起脂質過氧化、蛋白修飾、DNA損傷進而導致細胞凋亡、壞死、角膜神經節段性脫髓鞘、軸突變性、角膜神經功能障礙最終引起DK［12］。下文將分述OS如何與DK發病機制中的各重要物質相互作用。

　　3．1OS與AGEs

　　在DK中的相互作用AGEs是一組在蛋白質、脂肪酸或核酸的氨基基團與還原糖的醛基之間發生非酶性糖基化反應(又稱Maillard反應)所形成的一系列具有高度活性終產物的總稱，其結構具有高度異質性，最早由Maillard于1912年發現［13］。糖尿病患者在長期高糖狀態下體內合成過量AGEs蓄積在角膜各層，通過與糖基化終末受體(receptorforadvancedglycationendproducts，ＲAEG)的相互作用激活NADPH氧化酶，導致氧自由基的形成影響下游多條代謝通路，同時過量的ＲOS產生誘導ＲAGE表達，從而啟動正反饋循環，加劇氧化應激和炎癥的惡性循環［14］。AGEs與ＲAGE結合還導致MAPK、JAK/STAT等信號通路的激活，增加單核細胞趨化蛋白－1(monocytechemotacticprotein－1，MCP－1)、白細胞介素－6(interleukin－6，IL－6)、腫瘤壞死因子－α(tumornecrosisfactor，TNF－α)和血管細胞黏附分子－1(vascularcelladhesionmolecule－1，VCAM－1)的表達，引起炎性反應。ＲAGE的激活也可導致內質網應激和細胞凋亡［15－17］。有研究表明，通過抑制AGEs可以降低OS反應，對組織起到保護作用。Kim等［18］團隊將一種四味草藥提取物制成的藥物KIOM－79通過口服用于2型糖尿病大鼠模型，13wk后發現實驗組小鼠角膜厚度和細胞凋亡程度明顯低于對照組，且各層角膜組織AGEs的積累減少。此外，通過對相關標記物的檢測，其團隊還發現KIOM－79減弱了角膜中的氧化性DNA損傷、NF－κB激活和Bax過表達，說明其通過抑制氧化應激反應對角膜起到了保護性作用。大量報道顯示［19］，許多類型的天然化合物，如多酚、多糖、萜類、維生素和生物堿，都是抑制AGEs形成的良好候選者。這些化合物通過清除自由基、螯合金屬離子、捕獲活性羰基化合物、覆蓋蛋白質的糖化位點和降低血糖水平來阻止AGEs的形成。

　　3．2OS與沉默信息調節因子

　　1在DK間的相互作用沉默信息調節因子1(SIＲT1)是一種具有代表性的組蛋白脫乙酰酶，作為Sirtuin蛋白家族的一員，其酶活性依賴于NAD+作為輔助因子。SIＲT1通過組蛋白修飾控制基因表達、DNA修復、代謝、氧化應激反應、線粒體功能等來調節多種細胞活動［20］。SIＲT1調控氧化應激的機制主要包括:(1)通過去乙酰化激活過氧化物增殖子激活－受體因子γ輔激活因子(peroxisomeproliferator－activatedreceptorcoactivator－1，PGC－1α)的基因轉錄，并通過調節核受體過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAＲ)、核呼吸因子(NＲF)和線粒體轉錄因子A(TFAM)等基因的轉錄，參與調節線粒體功能［21］以及葡萄糖和脂質的代謝［22］。(2)SIＲT1調節抗氧化劑如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶的表達［23］。此外，由于線粒體功能障礙會導致細胞凋亡，SIＲT1可以通過介導PGC－1α的乙酰化直接調節細胞凋亡過程［24］。SIＲT1還通過調控NF－κBp65的乙酰化水平控制炎癥反應，同時調控炎癥因子相關基因的表達:如白細胞介素(IL)－1、腫瘤壞死因子α(TNF－α)、IL－8、IL－6等［21－22，25］。近年來，關于SIＲT1對DK作用機制的研究逐漸增多，且OS是不可或缺的一環。Wei等［26］研究發現在1型DM小鼠模型中，SIＲT1的下調可促進ＲOS的產生、抑制角膜上皮細胞活性促進細胞凋亡，可望通過調節SIＲT1的表達影響細胞內質網應激進而起到對DK的保護作用;Liu等［27］通過建立DM相關干眼小鼠模型觀察到相對于普通干眼對照組，OS反應顯著增強伴SIＲT1表達下降;Li等［28］發現NAD+含量和NAMPT表達在1型DM小鼠和2型DM患者中均下降，細胞實驗證明體外補充NAD+可恢復角膜上皮細胞增殖和遷移的能力，此外，在DM小鼠中，NAD+及其前體煙酰胺單核苷酸(nicotinamidemononucleotide，NMN)和煙酰胺核糖苷(nicotinamideriboside，NＲ)也促進角膜上皮和神經再生，同時還伴有SIＲT1、磷酸化的上皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFＲ)以及AKT和EＲK1/2的表達增加。

　　3．3OS與炎性反應在DK中的相互作用

　　炎癥是機體對病原體入侵、組織損傷和刺激物等各種病理過程的重要生理反應。慢性炎癥主要通過自由基的持續和過量產生以及抗氧化劑的消耗導致細胞損傷［29］。ＲOS可以刺激核因子－κB(NF－κB)和激活蛋白－1(AP－1)等轉錄因子，增加促炎細胞因子的表達。因此，有理由認為靶向氧化應激－炎癥細胞因子信號通路可能是治療糖尿病并發癥的潛在策略［30］。人高遷移率族蛋白B1(high－mobilitygroupbox1protein，HMGB1)是一種在轉錄調控中起重要作用的非組蛋白核蛋白［31］，HMGB1是介導糖尿病并發癥一關鍵的炎癥介質。它通過與晚期糖基化終末產物受體(receptorforadvancedglycationendproducts，ＲAGE)、Toll樣受體(TLＲ2和TLＲ4)結合激活NF－κB，進而導致促炎因子、黏附分子和血管生成因子的上調。Hou等［32］研究表明，HMGB1及其相關受體與DK的發生發展密切相關。蛋白質印跡結果顯示ＲAGE和TLＲ4(HMGB1受體)以及HMGB1相關信號通路也可能參與糖尿病角膜傷口和神經愈合。促炎性HMGB1信號轉導途徑主要通過其兩個受體TLＲ和ＲAGE進行轉導，最終增加NF－κB的活化和促炎性細胞因子的產生，包括TNF－α，IL－1β和IL－6。NF－κB的激活和促炎細胞因子的產生反過來又可以誘導HMGB1及其受體的表達，從而導致過度和持續的炎癥反應正反饋循環。給予外源性HMGB1肽可以明顯抑制糖尿病眼損傷后角膜上皮/角膜神經的恢復，而甘草酸二鉀(dipotassiumglycyrrhizinate，DG)(HMGB1抑制劑)治療可以顯著加速這種恢復過程。HMGB1的兩個受體ＲAGE和TLＲ4也被發現參與糖尿病患者角膜上皮/角膜神經愈合過程。這些結果表明HMGB1信號通路在DK的發展中起著至關重要的作用，有望通過對HMGB1的抑制調控炎癥反應進而治療DK并促進角膜神經修復。

　　3．4OS與內質網應激

　　在DK中的相互作用內質網(EＲ)是一種專職于蛋白質折疊和運輸的細胞器，對細胞內穩態和細胞外刺激的變化高度敏感。內質網應激(endoplasmicreticulumstress，EＲS)主要是由ＲOS積累、毒性物質、基因突變等引起應激反應，其應激原主要來自細胞內部環境改變，包括蛋白錯誤折疊、鈣穩態失調、未折疊蛋白聚集等內質網功能紊亂［33］。研究發現EＲS和OS存在相互作用:OS可誘導EＲS，相反EＲS也可以促進細胞內ＲOS生成。正常狀態下，細胞內部分ＲOS來源于內質網的氧化蛋白折疊過程中二硫鍵的形成，該過程中蛋白二硫化異構酶(proteindisulphideisomerase，PDI)通過內質網氧化酶1α(endoplasmicreticulumoxidase，EＲO1α)轉移電子給分子氧，相繼生成了副產物過氧化氫［34］。高糖狀態可誘發EＲS，上調的PDI和EＲO1α可導致大量過氧化氫形成，同時細胞代償功能有限，生成的還原性谷胱甘肽不足以中和超量的過氧化氫，繼而引起OS損傷。伴隨著細胞內線粒體裂解和鈣超載，EＲO1α介導的內質網鈣離子的釋放，亦可引起線粒體超氧化物的生成［35－36］。Wang等［37］的研究發現，中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF)在小鼠和人的角膜廣泛存在，其促進糖尿病患者角膜上皮修復和神經再生。主要機制是通過調控Akt信號通路抑制了高糖環境所致的細胞內質網應激及EＲS介導的細胞凋亡，MANF有望在改善DK患者角膜上皮延遲愈合和神經損傷再生中扮演重要角色。

　　4DK氧化應激的治療

　　4．1甘草酸

　　甘草酸(glycyrrhizin，GLY)是一種從甘草根中提取的皂苷類物質，具有抗炎等多種藥理作用，其已被證明對敗血癥、結腸炎腦損傷、角膜炎的動物模型有效［38－40］，在臨床上已被用于治療慢性肝炎患者。Somayajulu等［41］將GLY作用于高糖培養的小鼠角膜上皮細胞，發現其具有一定的保護作用，且降低了促炎癥反應和OS標志物如HMGB1、IL－1b、TLＲ2、TLＲ4、NOD樣受體蛋白3炎癥小體(NOD－，LＲＲ－andpyrindomain－containingprotein3，NLＲP3)、環氧合酶－2(cyclooxygenase2，COX2)、超氧化物歧化酶－2(superoxidedismutase2，SOD2)血紅素氧合酶－1(hemeoxygenase－1，HO－1)、谷胱甘肽過氧化酶2(glutathioneperoxidase2，GPX2)的表達量。另外該團隊在糖尿病小鼠模型的飲水中給予GLY，發現與對照組相比除了上述標志物，C－X－C型趨化因子配體2(C－X－Cmotifchemokineligand2，CXCL2)和誘導型一氧化氮合成酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)表達也下降，這進一步說明GLY對高糖所致的OS具有保護作用。

　　4．2色素上皮衍生因子

　　色素上皮衍生因子(PEDF)主要由視網膜色素上皮合成，是一種50kDa的分泌蛋白，屬于非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員［42］。它也存在于角膜、結膜和睫狀體上皮細胞、穆勒神經膠質細胞、視網膜星形膠質細胞和視網膜神經節細胞［43］。大量研究證明PEDF可以降低ＲAGE的表達并發揮抗氧化作用，Liu等［44］選取6周齡小鼠注射STZ建立1型DM小鼠模型，并給予50nmol/L量的PEDF滴眼每日3次，持續8wk后發現與給予人工淚液的DM對照組小鼠對比，其角膜上皮染色評分降低且淚液分泌量和角膜敏感性均有顯著提高。進一步對小鼠角膜行組織學檢測發現PEDF可減少DM小鼠角膜中ＲOS的累積、降低ＲAGE的表達以及增加抗氧化劑SOD1的表達，說明PEDF對DM所致的眼表損傷具有保護作用。

　　4．3α－硫辛酸

　　α－硫辛酸(alpha－lipoicacid，ALA)是一種天然存在的低分子量(206．32g/mol)二硫醇微量營養素，作為與線粒體代謝相關的生物能酶活性的輔助因子，它參與體內的物質代謝中的酰基轉移，能消除導致加速老化與致病的自由基。ALA的潛在抗氧化作用可歸因于直接活性氧(ＲOS)清除能力、金屬離子螯合能力和恢復細胞抗氧化劑的能力，如還原谷胱甘肽(GSH)、輔酶Q、維生素C和E水平。研究證明［45－47］ALA具有抗氧化的生物活性，對心血管疾病、炎癥、衰老和阿爾茨海默病認知功能障礙具有保護作用，因而其藥理機制受到關注。另外關于ALA的大多數臨床研究顯示了其在減輕DM患者的OS、神經病變和神經病變相關疼痛和感覺異常方面也具有較強潛力［48］。

　　5展望

　　OS參與眾多疾病的發生發展，其重要性體現在連接包括異常代謝、炎癥反應以及EＲS等多種發病機制。目前OS在DM眼部并發癥的研究主要集中在糖尿病視網膜病變，在DK中的研究尚有不足，且多局限于角膜上皮損傷修復，未來OS在DK的發病機制中的作用有待進一步研究。

　　作者:黃鈺清 楊燕寧