對2019年售零售散裝煙葉進行小規(guī)模的轉(zhuǎn)基因成分抽樣檢測，及時發(fā)現(xiàn)相關(guān)情況，為相關(guān)調(diào)查和科研提供參考。[方法]在貴陽（含三縣一市）地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場上隨機抽樣共30批次，參考GB/T24310-2009進行制樣檢測。[結(jié)果]所抽檢產(chǎn)品中檢出Nr內(nèi)源基因，未檢出pCaMV35S、NPTII、tNOS等轉(zhuǎn)基因成分。[結(jié)論]本次抽檢的貴陽市零售散裝煙葉中并未發(fā)現(xiàn)含有轉(zhuǎn)基因成分的批次。

　　關(guān)鍵詞：零售散裝煙葉；轉(zhuǎn)基因成分檢測；熒光PCR

　　1983年世界首例轉(zhuǎn)基因作物，即轉(zhuǎn)基因煙草，在美國研發(fā)成功；1994年，美FDA批準Monsanto公司的延熟保鮮轉(zhuǎn)基因西紅柿在美上市；2015年，AquaBounty的轉(zhuǎn)基因三文魚在加拿大上市。僅不到40年，轉(zhuǎn)基因物種就從研發(fā)到食用、從植物到動物，廣泛運用于實際生產(chǎn)并產(chǎn)生了巨大的社會和經(jīng)濟效益；隨之而來的是，眾多人工物種在短時間內(nèi)廣泛深入了人類社會和自然環(huán)境的諸多方面，帶來了巨大而難以預料的安全風險，成為了輿論關(guān)注的重要熱點。煙草作為轉(zhuǎn)基因模式作物，研究最早、范圍較廣[1]，我國發(fā)布的轉(zhuǎn)基因煙草的相關(guān)規(guī)范有國煙法[1998]168號《煙草基因工程研究及其應(yīng)用管理辦法》、國煙科[2003]387號《國家煙草專賣局關(guān)于加強對轉(zhuǎn)基因煙草監(jiān)控的通知》，在2005—2006年還陸續(xù)傳達了加強出口煙草轉(zhuǎn)基因檢測的幾個文件。本地市場上煙農(nóng)販售的散裝煙葉，具有一定的手工風味和少量的市場規(guī)模，但轉(zhuǎn)基因成分檢測研究較少。為初步了解售零售散裝煙葉是否含有轉(zhuǎn)基因成分及其所占比例，在地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場上進行隨機抽樣，依據(jù)GB/T24310-2009《煙草及煙草制品轉(zhuǎn)基因檢測方法》、參考SN/T1200-2003《煙草中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測方法》進行檢測，結(jié)果分析如下。

　　1材料與方法

　　抽樣：均為地區(qū)農(nóng)貿(mào)集散市場的臨時攤位上隨機抽樣，抽樣范圍為零售散裝煙葉共30批次。

　　2方法

　　檢測方法：根據(jù)GB/T24310-2009《煙草及煙草制品轉(zhuǎn)基因檢測方法》所列檢測基因（表1）及其引物、探針序列，由上海生工生物有限公司進行合成。陽性對照購自中檢院，為CaMV35S、NPTII、NOS、Bt-cry1A（c）、Cpti、EPSPS、CMV、PVY、TMV、CMVsat、PVYnib、T54D陽性質(zhì)粒，陰性對照為本實驗室留存的非轉(zhuǎn)基因煙草樣品（貴煙4號）、空白對照為3dH2O。熒光PCR試劑為QuantiTectMultiplexPCRKit，熒光PCR體系配置及反應(yīng)參數(shù)按上述試劑盒說明書，用熒光PCR儀ABI7500Fast檢測。

　　3結(jié)果

　　30批次的內(nèi)源基因NR均有明顯熒光S形曲線增長，且Ct值<30.0，表明均提取到煙草DNA；外源基因篩選檢測的CaMV35S、NPTII、NOS均未發(fā)現(xiàn)熒光信號增長，且Ct值>40.0，表明未檢出相關(guān)轉(zhuǎn)基因成分，由此，外源基因品系鑒定的Bt-cry1A（c）、Cpti、EPSPS、CMV、PVY、TMV、CMVsat、PVYnib、T54D也無需檢測。如圖1所示例，零售散裝煙葉前3批次樣品均如上所述。陽性對照、陰性對照、空白對照的檢測結(jié)果均符合試劑盒說明書要求（圖略）。

　　4討論

　　DNA提取：傳統(tǒng)的CTAB、SDS法提取樣品DNA，雖然純度和得率較高，但比較依賴實驗人員經(jīng)驗，如在酚類、異丙醇、乙醇等萃取階段，肉眼無法觀察到沉淀時，所需操作水平要求較高，不利于規(guī)模化檢測[5]；主流的DNA提取試劑盒、核酸提取工作站等，雖然具有模式化、便捷化的優(yōu)點，但也存在成本高、時間長的缺點[6]。在實際工作中，種子、鮮葉、初烤、片煙、卷煙等相對其他食品具有加工過程少、組織保存相對完好的特點，其DNA損失量較小，更適宜采用快提法[7-9]配合內(nèi)源基因檢測，同樣可避免假陰性結(jié)果。檢測方法：當前鑒定煙草中轉(zhuǎn)基因成分的主流技術(shù)手段，是通過PCR方法檢測樣品DNA中目的基因進行鑒定[10-11]。由于煙草是最早進行轉(zhuǎn)基因研發(fā)的模式植株，其外源基因種類較多，標準覆蓋面不盡完善，如FMV35S啟動子、Cry殺蟲毒蛋白家族、EPSPS抗草丁膦蛋白家族、PAT抗草丁膦蛋白家族等、各種抗病毒品系等也可納入檢測內(nèi)容。此外，關(guān)于檢測煙草中轉(zhuǎn)基因成分含量，目前行標SN/T1200-2003為定性、國標GB/T24310-2009兼有定性和定量、有文獻建立定量方法[12]；雖然通過熒光PCR進行定性檢測的操作和判定較為簡單，但對于實際生產(chǎn)來說，通過標物及標曲為基礎(chǔ)的定量檢測更具有實用價值和實際意義。

　　作者：陳永芳 董睿