對(duì)2019年售零售散裝煙葉進(jìn)行小規(guī)模的轉(zhuǎn)基因成分抽樣檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)相關(guān)情況，為相關(guān)調(diào)查和科研提供參考。[方法]在貴陽(yáng)（含三縣一市）地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上隨機(jī)抽樣共30批次，參考GB/T24310-2009進(jìn)行制樣檢測(cè)。[結(jié)果]所抽檢產(chǎn)品中檢出Nr內(nèi)源基因，未檢出pCaMV35S、NPTII、tNOS等轉(zhuǎn)基因成分。[結(jié)論]本次抽檢的貴陽(yáng)市零售散裝煙葉中并未發(fā)現(xiàn)含有轉(zhuǎn)基因成分的批次。

　　關(guān)鍵詞：零售散裝煙葉；轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)；熒光PCR

　　1983年世界首例轉(zhuǎn)基因作物，即轉(zhuǎn)基因煙草，在美國(guó)研發(fā)成功；1994年，美FDA批準(zhǔn)Monsanto公司的延熟保鮮轉(zhuǎn)基因西紅柿在美上市；2015年，AquaBounty的轉(zhuǎn)基因三文魚(yú)在加拿大上市。僅不到40年，轉(zhuǎn)基因物種就從研發(fā)到食用、從植物到動(dòng)物，廣泛運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)并產(chǎn)生了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益；隨之而來(lái)的是，眾多人工物種在短時(shí)間內(nèi)廣泛深入了人類社會(huì)和自然環(huán)境的諸多方面，帶來(lái)了巨大而難以預(yù)料的安全風(fēng)險(xiǎn)，成為了輿論關(guān)注的重要熱點(diǎn)。煙草作為轉(zhuǎn)基因模式作物，研究最早、范圍較廣[1]，我國(guó)發(fā)布的轉(zhuǎn)基因煙草的相關(guān)規(guī)范有國(guó)煙法[1998]168號(hào)《煙草基因工程研究及其應(yīng)用管理辦法》、國(guó)煙科[2003]387號(hào)《國(guó)家煙草專賣(mài)局關(guān)于加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草監(jiān)控的通知》，在2005—2006年還陸續(xù)傳達(dá)了加強(qiáng)出口煙草轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的幾個(gè)文件。本地市場(chǎng)上煙農(nóng)販?zhǔn)鄣纳⒀b煙葉，具有一定的手工風(fēng)味和少量的市場(chǎng)規(guī)模，但轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)研究較少。為初步了解售零售散裝煙葉是否含有轉(zhuǎn)基因成分及其所占比例，在地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上進(jìn)行隨機(jī)抽樣，依據(jù)GB/T24310-2009《煙草及煙草制品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法》、參考SN/T1200-2003《煙草中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測(cè)方法》進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分析如下。

　　1材料與方法

　　抽樣：均為地區(qū)農(nóng)貿(mào)集散市場(chǎng)的臨時(shí)攤位上隨機(jī)抽樣，抽樣范圍為零售散裝煙葉共30批次。

　　2方法

　　檢測(cè)方法：根據(jù)GB/T24310-2009《煙草及煙草制品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法》所列檢測(cè)基因（表1）及其引物、探針序列，由上海生工生物有限公司進(jìn)行合成。陽(yáng)性對(duì)照購(gòu)自中檢院，為CaMV35S、NPTII、NOS、Bt-cry1A（c）、Cpti、EPSPS、CMV、PVY、TMV、CMVsat、PVYnib、T54D陽(yáng)性質(zhì)粒，陰性對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室留存的非轉(zhuǎn)基因煙草樣品（貴煙4號(hào)）、空白對(duì)照為3dH2O。熒光PCR試劑為QuantiTectMultiplexPCRKit，熒光PCR體系配置及反應(yīng)參數(shù)按上述試劑盒說(shuō)明書(shū)，用熒光PCR儀ABI7500Fast檢測(cè)。

　　3結(jié)果

　　30批次的內(nèi)源基因NR均有明顯熒光S形曲線增長(zhǎng)，且Ct值<30.0，表明均提取到煙草DNA；外源基因篩選檢測(cè)的CaMV35S、NPTII、NOS均未發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)增長(zhǎng)，且Ct值>40.0，表明未檢出相關(guān)轉(zhuǎn)基因成分，由此，外源基因品系鑒定的Bt-cry1A（c）、Cpti、EPSPS、CMV、PVY、TMV、CMVsat、PVYnib、T54D也無(wú)需檢測(cè)。如圖1所示例，零售散裝煙葉前3批次樣品均如上所述。陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果均符合試劑盒說(shuō)明書(shū)要求（圖略）。

　　4討論

　　DNA提取：傳統(tǒng)的CTAB、SDS法提取樣品DNA，雖然純度和得率較高，但比較依賴實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)，如在酚類、異丙醇、乙醇等萃取階段，肉眼無(wú)法觀察到沉淀時(shí)，所需操作水平要求較高，不利于規(guī)模化檢測(cè)[5]；主流的DNA提取試劑盒、核酸提取工作站等，雖然具有模式化、便捷化的優(yōu)點(diǎn)，但也存在成本高、時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)[6]。在實(shí)際工作中，種子、鮮葉、初烤、片煙、卷煙等相對(duì)其他食品具有加工過(guò)程少、組織保存相對(duì)完好的特點(diǎn)，其DNA損失量較小，更適宜采用快提法[7-9]配合內(nèi)源基因檢測(cè)，同樣可避免假陰性結(jié)果。檢測(cè)方法：當(dāng)前鑒定煙草中轉(zhuǎn)基因成分的主流技術(shù)手段，是通過(guò)PCR方法檢測(cè)樣品DNA中目的基因進(jìn)行鑒定[10-11]。由于煙草是最早進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研發(fā)的模式植株，其外源基因種類較多，標(biāo)準(zhǔn)覆蓋面不盡完善，如FMV35S啟動(dòng)子、Cry殺蟲(chóng)毒蛋白家族、EPSPS抗草丁膦蛋白家族、PAT抗草丁膦蛋白家族等、各種抗病毒品系等也可納入檢測(cè)內(nèi)容。此外，關(guān)于檢測(cè)煙草中轉(zhuǎn)基因成分含量，目前行標(biāo)SN/T1200-2003為定性、國(guó)標(biāo)GB/T24310-2009兼有定性和定量、有文獻(xiàn)建立定量方法[12]；雖然通過(guò)熒光PCR進(jìn)行定性檢測(cè)的操作和判定較為簡(jiǎn)單，但對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，通過(guò)標(biāo)物及標(biāo)曲為基礎(chǔ)的定量檢測(cè)更具有實(shí)用價(jià)值和實(shí)際意義。

　　作者：陳永芳 董睿