關鍵詞：RNA干擾,siRNA,基因沉默,自身免疫病

　　摘要 ：RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種由小雙鏈RNA有效地作用于同源RNA序列誘發(fā)的“基因沉默”，在探查基因功能和治療人類疾病方面有廣闊的應用前景。小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)是RNAi的主要介導者，它通過雙鏈RNA(dsRNA)使同源基因沉默，也是最廣泛使用的以核酸為基礎來治療疾病的基因沉默技術。如今，siRNA已被應用于諸多研究領域，其在自身免疫病(如類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等)中的研究也日益增多。本文將對siRNA的發(fā)現(xiàn)、siRNA介導的基因沉默機制以及siRNA在自身免疫性疾病治療中的應用進行綜述。

　　1 siRNA的發(fā)現(xiàn)與作用機制

　　1.1 RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

　　1998年，線蟲基因組測序工作完成后，Andrew Fire和Craig Mello首次提出了一項新技術：通過雙鏈RNA(dsRNA)誘導特異基因的沉默，即RNA干擾[2]。這些雙鏈RNA是在體外轉錄正義RNA時所生成。1999年，Andrew Hamilton 和David Baulcombe隨后發(fā)現(xiàn)，在擬南芥的轉基因株和病毒誘導的轉錄后的基因沉默中，存在21-25 nt的RNA，該RNA與沉默基因序列互補，其來源是較長的雙鏈RNA前體，這些小分子雙鏈RNA即被稱為siRNA[3]。2001年，Elbashir等首次報道siRNA可特異性阻抑哺乳動物細胞靶基因表達，自此，siRNA作為一種新興的基因沉默技術被廣泛運用于生物學和醫(yī)學等研究領域。

　　1.2 siRNA在基因沉默中的作用機制

　　細胞內(nèi)的dsRNA(可以是來源于實驗導入的、異常表達的轉基因，RNA病毒，轉座子或者短的內(nèi)源發(fā)夾RNA分子)特異性與Dicer結合，以ATP依賴的方式被切割成siRNA。被Dicer酶切割成的siRNA具有相似的結構特征：長度為21-23 nt的雙鏈RNA，帶有3’ 端單鏈尾巴及磷酸化的5’ 端，互補雙鏈的3’ 端均有2-3nt的單鏈突出。siRNA中的一條鏈與蛋白復合物結合后形成RNA誘導沉默復合物(RNA Induced Silencing Complex, RISC)，同時解鏈，正義鏈離開，然后反義鏈在ATP的作用下，通過堿基互補配對原則與同源的靶mRNA結合，在核酸內(nèi)切酶的作用下，將靶mRNA切斷，從而阻斷其翻譯成蛋白質，達到基因沉默的目的。RISC是一種核酸和蛋白質的復合物，包括蛋白質和siRNA，已經(jīng)在果蠅和人類細胞中得到純化[4]。另一種情況是，siRNA與mRNA結合后，在依賴于RNA的聚合酶作用下以mRNA為模板、siRNA為引物指導合成dsRNA，然后Dicer酶再切割，導致mRNA降解[5]。

　　一些研究證明，siRNAs還有其他沉默機制，例如在幾種生物中能夠通過RNAi途徑修飾細胞染色質導致轉錄水平的基因沉默。

　　2 siRNA技術

　　2.1 siRNA的合成方法

　　目前較為常用的制備siRNA的方法有5種，包括：(1)化學合成：這是最初研究RNAi時所采用的方法，設計siRNA序列后，由合成儀按照序列進行合成，再進行后續(xù)的純化。(2)體外轉錄：這種方法采用T7 RNA聚合酶，以先合成的DNA鏈為模板分別轉錄合成正義和反義RNA，將正義和反義RNA混合。再經(jīng)退火復性得到dsRNA，從而使合成 dsRNA的成本大大降低。(3)長片段dsRNA經(jīng)酶降解：根據(jù)siRNA形成的原理，首先針對靶基因的mRNA在體外轉錄合成長的dsRNA。然后在體外用Dicer酶(或者RNase)消化。這樣就形成了含有多個針對目的基因的2l bp的siRNA混合物，再將該混合物轉染至細胞。(4)siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNA：先在體外構建能表達dsRNA的載體，再將其轉移到細胞內(nèi)，合成dsRNA;(5)聚合酶鏈式反應(PCR)制備的siRNA表達框在細胞中表達：是一種由PCR得到的siRNA表達模板。包括一個RNApol Ⅲ啟動子、一段發(fā)夾結構siRNA和一個RNApol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中[6]。前3種方法經(jīng)過體外制備siRNA，然后應用專門的RNA轉染試劑將其轉染到細胞內(nèi)，或者采用電轉染法將其導入哺乳動物細胞;后兩種方法不需要直接操作RNA，依賴能夠表達siRNA的DNA載體或者基于PCR的表達載體轉染到細胞中，通過轉染到細胞的DNA模板在體內(nèi)的轉錄得到siRNA。

　　2.2 siRNA導入哺乳動物細胞的策略

　　在哺乳動物細胞中通常通過RNAi阻斷特定基因的表達，從而可研究相關基因的功能。此研究的基礎在于成功地將siRNA導入細胞。常見的導入策略是將靶向特定基因的約21堿基長短的雙鏈siRNAs，或者45-50-mer的發(fā)夾結構RNA(small hairpin RNA, shRNA)轉染到細胞內(nèi)[7]。此外，通過質粒表達siRNAs同樣可以抑制特定基因的表達。

　　3 siRNA在自身免疫病治療中的應用

　　3.1 類風濕性關節(jié)炎

　　類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，慢性、對稱性、多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變?yōu)槠渲饕�的臨床表現(xiàn)。

　　目前，類風濕性關節(jié)炎的確切病因還未完全闡明，但一些研究證實，細胞因子在軟骨和骨侵蝕中有重要的作用，如TNF-α和IL-1。用抗TNF-α和抗IL-1的單克隆抗體治療，可顯著降低軟骨和骨侵蝕[8]。天然的IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)已在類風濕性關節(jié)炎體內(nèi)模型中使用。IL-1Ra的基因治療可顯著減少實驗性類風濕性關節(jié)炎模型小鼠的關節(jié)損傷。

　　運用siRNA技術沉默疾病相關基因的表達，對類風濕性關節(jié)炎的治療也具有廣泛的應用前景。如siRNA沉默樹突細胞中的CD40、CD80和CD86，可抑制膠原誘導的關節(jié)炎的發(fā)生。腺相關病毒(AAV)5型介導的關節(jié)內(nèi)TNF-siRNA，可改善小鼠膠原誘導的關節(jié)炎。慢病毒載體介導的TNF超家族成員B細胞激活因子的基因沉默，可抑制Th17細胞的增殖、改善小鼠中自身免疫性關節(jié)炎的病情[9]。

　　而不同的siRNA轉運載體可增加siRNA在全身循環(huán)的時間，幫助其穿過細胞膜。用siRNA納米顆粒下調(diào)TNF-α，可減少膠原誘導的關節(jié)炎小鼠中關節(jié)局部和全身的炎癥反應。在類風濕性關節(jié)炎中，siRNA納米顆粒的生物分布受到激活的免疫細胞影響，如調(diào)節(jié)性T細胞和活化的巨噬細胞等。但siRNA納米顆粒如何能夠選擇性抑制自身免疫應答，卻不影響其他免疫功能，至今尚未明確[8]。Aouadi等設計β1,3-D葡聚糖包裹的siRNA微粒，作為一個高效的口服運載工具，沉默小鼠體內(nèi)巨噬細胞的一種介導細胞因子表達的酶MAKP kinase kinase kinase 4(Map4k4)。該siRNA通過抑制TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，來保護小鼠免于脂多糖(LPS)誘導的致死[10]。這一技術定義了一個新的口服傳送siRNA的策略，以此來減弱系統(tǒng)性炎癥應答，如類風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化和炎癥性腸病等。在局部關節(jié)內(nèi)運送TNF-α或IL-1β特異的siRNA，可在形態(tài)學、放射學、組織學水平上有效改善大鼠膠原誘導的關節(jié)炎[9]。體內(nèi)間接轉運siRNA也在關節(jié)炎的模型中被廣泛研究。靜脈轉運包含TNF siRNA的陽離子脂質體(lipoplex)，可顯著抑制TNF在膝關節(jié)的產(chǎn)生，并在類風濕性關節(jié)炎小鼠模型中顯示，能完全治愈關節(jié)炎的發(fā)生[11]。

　　另有研究發(fā)現(xiàn)，將FcγRIII(CD16)的siRNA注射到關節(jié)炎患者顳下頜關節(jié)的關節(jié)間隙，可使FcγRIII陽性的細胞數(shù)量減少，該細胞主要負責與IgG結合、激活細胞和刺激細胞因子釋放[12]。

　　在關節(jié)炎發(fā)生的早期階段，抗IL-6生物制劑對類風濕性關節(jié)炎有治療作用。然而，用siRNA沉默IL-6和體內(nèi)NF-kB的配體激活劑——RANKL，對炎癥和骨損傷卻無治療作用，但一些研究報道，同時沉默TNF-α和RANKL比單獨沉默RANKL有更為明顯的治療效果[13]。

　　3.2 系統(tǒng)性紅斑狼瘡

　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種彌漫性、全身性自身免疫病，主要累及皮膚粘膜、骨骼肌肉、腎臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時還可以累及肺、心臟、血液等多個器官和系統(tǒng)，血清中可檢測到多種自身抗體和免疫學異常。

　　IL-2是促進免疫應答的細胞因子。IL-2對于調(diào)節(jié)性T細胞的形成和功能也有非常重要的作用，對于全身性自身免疫應答，如SLE有重要的控制作用。IL-2的減少是SLE最主要的免疫病理學表現(xiàn)，在SLE疾病模型小鼠和SLE患者中都發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生IL-2的T細胞數(shù)量明顯減少。IL-2的減少可增加機體對傳染病的敏感性，亦可減少活化誘導的細胞死亡[14]。

　　蛋白磷酸酶2A是(PP2Ac)T淋巴細胞中的一種轉錄因子——磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(pCREB)去磷酸化的主要參與酶。在SLE患者中，蛋白磷酸酶2A催化亞單位的信號強度、蛋白含量、酶活性均增加。研究顯示，pCREB能抑制IL-2的產(chǎn)生。用PP2Ac-siRNA處理SLE的T細胞，可降低PP2Ac的蛋白水平和活性，增加cAMP的磷酸化水平，促進pCREB與IL-2、c-fos啟動子的結合，從而恢復IL-2的分泌水平[15]。因此，PP2Ac-siRNA可作為一個新型的工具，來調(diào)整SLE患者中T細胞產(chǎn)生IL-2的水平。

　　3.3 多發(fā)性硬化

　　多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，該病的病變位于腦部或脊髓，中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生大小不一的塊狀髓鞘脫失而導致臨床癥狀。

　　在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP-1)是一個對細胞因子的信號、炎癥基因表達和中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘極為重要的負調(diào)控因子。SHP-1是一個含有兩個SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶，通過STAT1，STAT3和STAT6負向調(diào)節(jié)炎性細胞因子介導的信號通路。相關人體研究表明，MS患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中包含激活轉錄因子NF-κB、STAT1、STAT3和 STAT6，這些轉錄因子能刺激炎癥信號通路，提示MS中炎癥信號通路的激活可能是導致炎性脫髓鞘反應的原因之一[16]。

　　多發(fā)性硬化中SHP-1蛋白和基因水平明顯低于正常人。MS患者PBMCs低表達SHP-1，而STAT6磷酸化水平升高，這些改變增強了炎癥脫髓鞘的激活。研究發(fā)現(xiàn)，將MS患者和正常人的PBMCs用抗SHP-1的siRNA處理后，MS患者PBMCs中pSTAT6的表達水平增加;用IL-4刺激這些細胞后，SHP-1-siRNA誘導的pSTAT6水平顯著增加[17]。而運用STAT6的siRNA則能有效地降低MS患者單個核細胞中磷酸化STAT6的水平。用表達SHP-1的慢病毒轉染PBMCs可減低磷酸化的STAT的含量[18]。

　　3.4 自身免疫性肝病

　　自身免疫性肝病是一種特殊類型的慢性肝病，是由自身免疫反應引起的肝臟慢性炎癥。臨床上最典型的包括自身免疫性肝炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化兩類。

　　在動物肝損傷模型中，肝毒素和病毒性肝炎通過細胞死亡受體Fas導致肝細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠靜脈注射Fas-siRNA后，自身免疫性肝炎小鼠的肝細胞毒性明顯減少，小鼠存活時間延長。證明通過RNA干擾靶向沉默死亡受體Fas，對自身免疫性肝炎小鼠具有保護作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，沉默caspase-8(Fas受體的下游信號通路)，也能對自身免疫性肝炎和病毒性肝炎起到保護[19]。因此，通過以促凋亡基因為靶向的RNA干擾來治療肝炎具有潛在的可能性。

　　4 總結與展望

　　自1998年發(fā)現(xiàn)以來，RNAi已成為生命科學研究的一大熱點，并且有著誘人的應用前景，它的運用在短時間內(nèi)從體外細胞、動物試驗發(fā)展到臨床試驗，展示其極大的優(yōu)越性。作為RNAi主要介導者之一，siRNA以其合成相對簡單，生產(chǎn)成本較低，已逐漸成為一個非常吸引人的小分子藥物家族。活性siRNA轉運載體的運用在生物學和臨床疾病治療中產(chǎn)生了巨大的影響。SiRNA在靶向調(diào)控自身免疫病中有著廣闊的應用前景，將為各種自身免疫病的治療提供重要的理論和實驗依據(jù)，其在自身免疫性疾病的調(diào)控和治療中也發(fā)揮著越來越重要的作用。