關鍵詞：RNA干擾,siRNA,基因沉默,自身免疫病

　　摘要 ：RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種由小雙鏈RNA有效地作用于同源RNA序列誘發的“基因沉默”，在探查基因功能和治療人類疾病方面有廣闊的應用前景。小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)是RNAi的主要介導者，它通過雙鏈RNA(dsRNA)使同源基因沉默，也是最廣泛使用的以核酸為基礎來治療疾病的基因沉默技術。如今，siRNA已被應用于諸多研究領域，其在自身免疫病(如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化等)中的研究也日益增多。本文將對siRNA的發現、siRNA介導的基因沉默機制以及siRNA在自身免疫性疾病治療中的應用進行綜述。

　　1 siRNA的發現與作用機制

　　1.1 RNA干擾的發現

　　1998年，線蟲基因組測序工作完成后，Andrew Fire和Craig Mello首次提出了一項新技術：通過雙鏈RNA(dsRNA)誘導特異基因的沉默，即RNA干擾[2]。這些雙鏈RNA是在體外轉錄正義RNA時所生成。1999年，Andrew Hamilton 和David Baulcombe隨后發現，在擬南芥的轉基因株和病毒誘導的轉錄后的基因沉默中，存在21-25 nt的RNA，該RNA與沉默基因序列互補，其來源是較長的雙鏈RNA前體，這些小分子雙鏈RNA即被稱為siRNA[3]。2001年，Elbashir等首次報道siRNA可特異性阻抑哺乳動物細胞靶基因表達，自此，siRNA作為一種新興的基因沉默技術被廣泛運用于生物學和醫學等研究領域。

　　1.2 siRNA在基因沉默中的作用機制

　　細胞內的dsRNA(可以是來源于實驗導入的、異常表達的轉基因，RNA病毒，轉座子或者短的內源發夾RNA分子)特異性與Dicer結合，以ATP依賴的方式被切割成siRNA。被Dicer酶切割成的siRNA具有相似的結構特征：長度為21-23 nt的雙鏈RNA，帶有3’ 端單鏈尾巴及磷酸化的5’ 端，互補雙鏈的3’ 端均有2-3nt的單鏈突出。siRNA中的一條鏈與蛋白復合物結合后形成RNA誘導沉默復合物(RNA Induced Silencing Complex, RISC)，同時解鏈，正義鏈離開，然后反義鏈在ATP的作用下，通過堿基互補配對原則與同源的靶mRNA結合，在核酸內切酶的作用下，將靶mRNA切斷，從而阻斷其翻譯成蛋白質，達到基因沉默的目的。RISC是一種核酸和蛋白質的復合物，包括蛋白質和siRNA，已經在果蠅和人類細胞中得到純化[4]。另一種情況是，siRNA與mRNA結合后，在依賴于RNA的聚合酶作用下以mRNA為模板、siRNA為引物指導合成dsRNA，然后Dicer酶再切割，導致mRNA降解[5]。

　　一些研究證明，siRNAs還有其他沉默機制，例如在幾種生物中能夠通過RNAi途徑修飾細胞染色質導致轉錄水平的基因沉默。

　　2 siRNA技術

　　2.1 siRNA的合成方法

　　目前較為常用的制備siRNA的方法有5種，包括：(1)化學合成：這是最初研究RNAi時所采用的方法，設計siRNA序列后，由合成儀按照序列進行合成，再進行后續的純化。(2)體外轉錄：這種方法采用T7 RNA聚合酶，以先合成的DNA鏈為模板分別轉錄合成正義和反義RNA，將正義和反義RNA混合。再經退火復性得到dsRNA，從而使合成 dsRNA的成本大大降低。(3)長片段dsRNA經酶降解：根據siRNA形成的原理，首先針對靶基因的mRNA在體外轉錄合成長的dsRNA。然后在體外用Dicer酶(或者RNase)消化。這樣就形成了含有多個針對目的基因的2l bp的siRNA混合物，再將該混合物轉染至細胞。(4)siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNA：先在體外構建能表達dsRNA的載體，再將其轉移到細胞內，合成dsRNA;(5)聚合酶鏈式反應(PCR)制備的siRNA表達框在細胞中表達：是一種由PCR得到的siRNA表達模板。包括一個RNApol Ⅲ啟動子、一段發夾結構siRNA和一個RNApol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中[6]。前3種方法經過體外制備siRNA，然后應用專門的RNA轉染試劑將其轉染到細胞內，或者采用電轉染法將其導入哺乳動物細胞;后兩種方法不需要直接操作RNA，依賴能夠表達siRNA的DNA載體或者基于PCR的表達載體轉染到細胞中，通過轉染到細胞的DNA模板在體內的轉錄得到siRNA。

　　2.2 siRNA導入哺乳動物細胞的策略

　　在哺乳動物細胞中通常通過RNAi阻斷特定基因的表達，從而可研究相關基因的功能。此研究的基礎在于成功地將siRNA導入細胞。常見的導入策略是將靶向特定基因的約21堿基長短的雙鏈siRNAs，或者45-50-mer的發夾結構RNA(small hairpin RNA, shRNA)轉染到細胞內[7]。此外，通過質粒表達siRNAs同樣可以抑制特定基因的表達。

　　3 siRNA在自身免疫病治療中的應用

　　3.1 類風濕性關節炎

　　類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關節滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，慢性、對稱性、多滑膜關節炎和關節外病變為其主要的臨床表現。

　　目前，類風濕性關節炎的確切病因還未完全闡明，但一些研究證實，細胞因子在軟骨和骨侵蝕中有重要的作用，如TNF-α和IL-1。用抗TNF-α和抗IL-1的單克隆抗體治療，可顯著降低軟骨和骨侵蝕[8]。天然的IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)已在類風濕性關節炎體內模型中使用。IL-1Ra的基因治療可顯著減少實驗性類風濕性關節炎模型小鼠的關節損傷。

　　運用siRNA技術沉默疾病相關基因的表達，對類風濕性關節炎的治療也具有廣泛的應用前景。如siRNA沉默樹突細胞中的CD40、CD80和CD86，可抑制膠原誘導的關節炎的發生。腺相關病毒(AAV)5型介導的關節內TNF-siRNA，可改善小鼠膠原誘導的關節炎。慢病毒載體介導的TNF超家族成員B細胞激活因子的基因沉默，可抑制Th17細胞的增殖、改善小鼠中自身免疫性關節炎的病情[9]。

　　而不同的siRNA轉運載體可增加siRNA在全身循環的時間，幫助其穿過細胞膜。用siRNA納米顆粒下調TNF-α，可減少膠原誘導的關節炎小鼠中關節局部和全身的炎癥反應。在類風濕性關節炎中，siRNA納米顆粒的生物分布受到激活的免疫細胞影響，如調節性T細胞和活化的巨噬細胞等。但siRNA納米顆粒如何能夠選擇性抑制自身免疫應答，卻不影響其他免疫功能，至今尚未明確[8]。Aouadi等設計β1,3-D葡聚糖包裹的siRNA微粒，作為一個高效的口服運載工具，沉默小鼠體內巨噬細胞的一種介導細胞因子表達的酶MAKP kinase kinase kinase 4(Map4k4)。該siRNA通過抑制TNF-α和IL-1β的產生，來保護小鼠免于脂多糖(LPS)誘導的致死[10]。這一技術定義了一個新的口服傳送siRNA的策略，以此來減弱系統性炎癥應答，如類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化和炎癥性腸病等。在局部關節內運送TNF-α或IL-1β特異的siRNA，可在形態學、放射學、組織學水平上有效改善大鼠膠原誘導的關節炎[9]。體內間接轉運siRNA也在關節炎的模型中被廣泛研究。靜脈轉運包含TNF siRNA的陽離子脂質體(lipoplex)，可顯著抑制TNF在膝關節的產生，并在類風濕性關節炎小鼠模型中顯示，能完全治愈關節炎的發生[11]。

　　另有研究發現，將FcγRIII(CD16)的siRNA注射到關節炎患者顳下頜關節的關節間隙，可使FcγRIII陽性的細胞數量減少，該細胞主要負責與IgG結合、激活細胞和刺激細胞因子釋放[12]。

　　在關節炎發生的早期階段，抗IL-6生物制劑對類風濕性關節炎有治療作用。然而，用siRNA沉默IL-6和體內NF-kB的配體激活劑——RANKL，對炎癥和骨損傷卻無治療作用，但一些研究報道，同時沉默TNF-α和RANKL比單獨沉默RANKL有更為明顯的治療效果[13]。

　　3.2 系統性紅斑狼瘡

　　系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種彌漫性、全身性自身免疫病，主要累及皮膚粘膜、骨骼肌肉、腎臟及中樞神經系統，同時還可以累及肺、心臟、血液等多個器官和系統，血清中可檢測到多種自身抗體和免疫學異常。

　　IL-2是促進免疫應答的細胞因子。IL-2對于調節性T細胞的形成和功能也有非常重要的作用，對于全身性自身免疫應答，如SLE有重要的控制作用。IL-2的減少是SLE最主要的免疫病理學表現，在SLE疾病模型小鼠和SLE患者中都發現能產生IL-2的T細胞數量明顯減少。IL-2的減少可增加機體對傳染病的敏感性，亦可減少活化誘導的細胞死亡[14]。

　　蛋白磷酸酶2A是(PP2Ac)T淋巴細胞中的一種轉錄因子——磷酸化環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(pCREB)去磷酸化的主要參與酶。在SLE患者中，蛋白磷酸酶2A催化亞單位的信號強度、蛋白含量、酶活性均增加。研究顯示，pCREB能抑制IL-2的產生。用PP2Ac-siRNA處理SLE的T細胞，可降低PP2Ac的蛋白水平和活性，增加cAMP的磷酸化水平，促進pCREB與IL-2、c-fos啟動子的結合，從而恢復IL-2的分泌水平[15]。因此，PP2Ac-siRNA可作為一個新型的工具，來調整SLE患者中T細胞產生IL-2的水平。

　　3.3 多發性硬化

　　多發性硬化(multiple sclerosis, MS)是一種中樞神經系統脫髓鞘疾病，該病的病變位于腦部或脊髓，中樞神經系統產生大小不一的塊狀髓鞘脫失而導致臨床癥狀。

　　在小鼠的研究中發現，蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP-1)是一個對細胞因子的信號、炎癥基因表達和中樞神經系統脫髓鞘極為重要的負調控因子。SHP-1是一個含有兩個SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶，通過STAT1，STAT3和STAT6負向調節炎性細胞因子介導的信號通路。相關人體研究表明，MS患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中包含激活轉錄因子NF-κB、STAT1、STAT3和 STAT6，這些轉錄因子能刺激炎癥信號通路，提示MS中炎癥信號通路的激活可能是導致炎性脫髓鞘反應的原因之一[16]。

　　多發性硬化中SHP-1蛋白和基因水平明顯低于正常人。MS患者PBMCs低表達SHP-1，而STAT6磷酸化水平升高，這些改變增強了炎癥脫髓鞘的激活。研究發現，將MS患者和正常人的PBMCs用抗SHP-1的siRNA處理后，MS患者PBMCs中pSTAT6的表達水平增加;用IL-4刺激這些細胞后，SHP-1-siRNA誘導的pSTAT6水平顯著增加[17]。而運用STAT6的siRNA則能有效地降低MS患者單個核細胞中磷酸化STAT6的水平。用表達SHP-1的慢病毒轉染PBMCs可減低磷酸化的STAT的含量[18]。

　　3.4 自身免疫性肝病

　　自身免疫性肝病是一種特殊類型的慢性肝病，是由自身免疫反應引起的肝臟慢性炎癥。臨床上最典型的包括自身免疫性肝炎和原發性膽汁性肝硬化兩類。

　　在動物肝損傷模型中，肝毒素和病毒性肝炎通過細胞死亡受體Fas導致肝細胞凋亡。研究發現，小鼠靜脈注射Fas-siRNA后，自身免疫性肝炎小鼠的肝細胞毒性明顯減少，小鼠存活時間延長。證明通過RNA干擾靶向沉默死亡受體Fas，對自身免疫性肝炎小鼠具有保護作用。最近研究發現，沉默caspase-8(Fas受體的下游信號通路)，也能對自身免疫性肝炎和病毒性肝炎起到保護[19]。因此，通過以促凋亡基因為靶向的RNA干擾來治療肝炎具有潛在的可能性。

　　4 總結與展望

　　自1998年發現以來，RNAi已成為生命科學研究的一大熱點，并且有著誘人的應用前景，它的運用在短時間內從體外細胞、動物試驗發展到臨床試驗，展示其極大的優越性。作為RNAi主要介導者之一，siRNA以其合成相對簡單，生產成本較低，已逐漸成為一個非常吸引人的小分子藥物家族。活性siRNA轉運載體的運用在生物學和臨床疾病治療中產生了巨大的影響。SiRNA在靶向調控自身免疫病中有著廣闊的應用前景，將為各種自身免疫病的治療提供重要的理論和實驗依據，其在自身免疫性疾病的調控和治療中也發揮著越來越重要的作用。