探討菘藍(lán)花藥處于單核晚期的形態(tài)指標(biāo)，并以適宜發(fā)育時(shí)期的花藥為外植體，進(jìn)行花藥培養(yǎng)及單倍體誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4℃低溫處理2 d后，在含有6-BA 0.5 mg- L-I和NAA l.0 mg.L-1的MS培養(yǎng)基上，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率為23. 35%;將其轉(zhuǎn)接到MS附加6-BA l.0 mg- L-l，NAA 0.5 mg.L-I的分化培養(yǎng)基上，80. 00%以上的愈傷組織可以誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽;再將分化出的試管苗轉(zhuǎn)接到1/2MS+NAA1.0 mg.L-l的生根培養(yǎng)基上，3d左右即可獲得完整植株。經(jīng)葉邊緣壓片檢查染色體數(shù)目，花藥培養(yǎng)所得的弱小綠苗為單倍體植株。

　　推薦期刊：　《植物科學(xué)學(xué)報(bào)》(雙月刊)創(chuàng)刊于1983年，為科學(xué)出版社出版的植物學(xué)綜合性學(xué)術(shù)期刊(學(xué)報(bào)級(jí))，國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)行。本刊宗旨：促進(jìn)學(xué)術(shù)交流，推動(dòng)學(xué)科發(fā)展，為國(guó)民經(jīng)濟(jì)建設(shè)服務(wù)。獲獎(jiǎng)情況：1989年，《武漢植物學(xué)研究》被湖北省科委、湖北省科協(xié)、湖北省新聞出版局、湖北省科學(xué)技術(shù)期刊編輯學(xué)會(huì)評(píng)為“湖北省優(yōu)秀科技期刊”。1992年，被中共湖北省委宣傳部、湖北省科委、湖北省新聞出版局評(píng)為“湖北省優(yōu)秀科技期刊”。、1995年，被中共湖北省委宣傳部、湖北省新聞出版局、湖北省科委授予“1994-1995年度湖北省優(yōu)秀期刊”稱(chēng)號(hào)，并被評(píng)定為一級(jí)期刊。

　　關(guān)鍵詞：菘藍(lán);花藥培養(yǎng);單倍體

　　菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort.)為十字花科( Cruciferae)菘藍(lán)屬(Isatis)二年生草本植物，其根(板藍(lán)根)和葉(大青葉)均可入藥，是2010版《中國(guó)藥典(一部)》收錄的常用中藥品種，原產(chǎn)我國(guó)，全國(guó)各地均有栽培。菘藍(lán)具有清熱解毒、涼血消斑、利咽止痛之功效，含有靛藍(lán)、靛玉紅、有機(jī)酸、多糖等多種有效成分，廣泛用于治療流感、腮腺炎、乙腦、肝炎等多種疾病，其多糖組分具有一定的免疫調(diào)節(jié)和降血脂作用，而靛玉紅對(duì)治療慢性粒細(xì)胞白血病有較好的作用(劉海利，2002)。

　　單倍體育種過(guò)程中，植株經(jīng)染色體加倍后，在一個(gè)世代中即可出現(xiàn)純合二倍體，其性狀不分離，表型整齊一致，育種年限顯著縮短。由于沒(méi)有顯性基因的掩蓋，隱性基因控制的性狀容易顯現(xiàn)，這對(duì)誘變育種和遺傳突變研究具有較大的優(yōu)勢(shì)。我國(guó)應(yīng)用單倍體育種技術(shù)先后育成了煙草、水稻、小麥等多個(gè)優(yōu)良品種。目前，關(guān)于菘藍(lán)組織培養(yǎng)及植株再生體系建立的文獻(xiàn)較多(涂玉琴等，2009;張菊紅等，2006;張勝珍等，2009;汪洪等，2008)，但有關(guān)菘藍(lán)花藥培養(yǎng)及單倍體誘導(dǎo)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以菘藍(lán)花藥為試材，研究花藥培養(yǎng)及植株再生的適宜條件，以期為菘藍(lán)單倍體育種提供一定的研究基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1.1材料

　　2009年4-5月間，隨機(jī)抽取種植于本校試驗(yàn)田二年生的菘藍(lán)花藥為實(shí)驗(yàn)材料。

　　1.2方法

　　1.2.1小孢子發(fā)育時(shí)期的檢測(cè)取材當(dāng)日7：00-10: 00摘取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、直徑不同、閉合的菘藍(lán)花蕾，同時(shí)觀察記錄花蕾特征和花藥顏色;將花藥置于卡諾固定液中處理24 h后，用改良苯酚試劑染色，壓片鏡檢花粉小孢子的發(fā)育時(shí)期。

　　1.2.2花藥的預(yù)處理與培養(yǎng)將花蕾置于4℃冰箱，分別進(jìn)行0、2、4、8和12 d的預(yù)處理。接種前，將花蕾用流水沖洗1—2h，常規(guī)消毒后用濾紙吸干表面水分，小心剝?nèi)』ㄋ帲�并接種于不同的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。觀察并記錄愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化與增殖、植株再生等情況。

　　1.2.3培養(yǎng)條件培養(yǎng)用基本培養(yǎng)基為MS，附加瓊脂6.5 g -L“，蔗糖30g-L“，滅菌后pH值為5.8左右。培養(yǎng)室溫度為(25土2)℃，光照強(qiáng)度為2 000~3 000ymol.m-2.s。1，每天光照12—14 h。1.2.4再生植株的倍性鑒定將試管苗葉片于流水中沖洗10 min，再用蒸餾水沖洗3次;切取葉邊緣組織，并用0.002 mol.1-1 8一羥基喹啉預(yù)處理2h，于卡諾固定液中固定24 h;轉(zhuǎn)入1 mol.L-l HCI中解離IO min，改良苯酚品紅試劑染色20 min，壓片、鏡檢染色體數(shù)目并拍照(段英姿等，2006)。同法取正常二倍體菘藍(lán)試管苗為對(duì)照，進(jìn)行染色體制片并計(jì)數(shù)、拍照。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1小孢子發(fā)育時(shí)期的鑒定

　　鏡檢結(jié)果表明，花蕾直徑小于0. 15 cm時(shí)，小孢子發(fā)育不成熟或處于單核早期，培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞分裂能力差，花藥存活力低;直徑大于0. 25 cm時(shí)，花蕾逐漸展開(kāi)，花冠黃色，小孢子已發(fā)育至雙核至三核期，不宜作為花藥培養(yǎng)的外植體;而直徑在0.15 N0. 25 cm之間的閉合花蕾，花冠呈淡綠色至淡黃色，50%以上的小孢子處于單核中期至后期(靠邊期)。因此，菘藍(lán)花藥培養(yǎng)時(shí)，宜在取材當(dāng)日選取健康、無(wú)病蟲(chóng)害，花冠顏色為淡綠至淡黃色，直徑0. 15~0.25 cm、閉合花蕾中的花藥作為單倍體誘導(dǎo)的適宜外植體。

　　2.2花藥愈傷組織的誘導(dǎo)

　　2.2.1不同激素組合對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響 接種一周左右，部分花藥開(kāi)始膨大、縱裂并伴有愈傷組織的形成。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，整個(gè)花藥完全脫分化成黃綠色、疏松的愈傷組織(圖l：a)，并最終轉(zhuǎn)為綠色、結(jié)構(gòu)致密的愈傷組織(圖1：b)，不同激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響作用如表1所示。

　　從表1可以看出，花藥在MS附加6-BA 0.5mg.L-I和NAA l.0 mg.L-l的培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)6d的培養(yǎng)即可誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)率為20. 35 010;而添加了2，4-D的培養(yǎng)基組合中愈傷組織的誘導(dǎo)率分別在9. 30%到15. 00%之間不等。同時(shí)，添加2，4-D后愈傷組織的形成時(shí)間明顯推遲至10 d以上，推測(cè)2，4-D對(duì)菘藍(lán)花藥愈傷組織的形成具有一定的抑制作用。因此，適宜菘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS附加6一BA O.5 mg. L-1和NAA l.0 mg.L。2.2.2不同低溫預(yù)處理對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響與對(duì)照組相比，適當(dāng)?shù)牡蜏仡A(yù)處理能夠在一定程度上提高愈傷組織誘導(dǎo)率，同時(shí)縮短愈傷組織的形成時(shí)間。如2 d( 23. 35%)和4d( 18. 57%)的低溫預(yù)處理均較對(duì)照(15.26%)明顯地提高了愈傷組織誘導(dǎo)率。在相同的培養(yǎng)基中，與2.2.1項(xiàng)的結(jié)果(20.35%)相比，2 d的低溫預(yù)處理(23.35%)可以進(jìn)一步提高愈傷組織誘導(dǎo)率;而較長(zhǎng)的低溫預(yù)處理時(shí)間會(huì)在一定程度上降低愈傷組織誘導(dǎo)率，并延長(zhǎng)其形成時(shí)間。因此，適宜菘藍(lán)愈傷組織誘導(dǎo)的低溫預(yù)處理時(shí)間為2 d。觀察結(jié)果表明，花藥培養(yǎng)一段時(shí)間后，藥隔處首先開(kāi)裂，進(jìn)而形成淡黃色的愈傷組織(圖1：a)。培養(yǎng)初期愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，隨后逐漸加快，7d左右愈傷組織塊直徑可達(dá)1.5 cm以上，顏色由淡黃轉(zhuǎn)為淡綠，質(zhì)地由疏松轉(zhuǎn)為致密(圖1：b)。

　　2.3花藥愈傷組織的增殖、分化及完整植株的獲得

　　將花藥愈傷組織接種到MS附加6- BA1.0 mg.L-I和NAA 2.0 mg.L-l的培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)25 d左右的培養(yǎng)，愈傷組織旺盛生長(zhǎng)并明顯增殖。2—3次繼代培養(yǎng)后，將其轉(zhuǎn)入MS附加6-BA1.0 mg.L-I，NAA 0.5 mg.L-1的培養(yǎng)基中，6d左右可以見(jiàn)到綠色芽點(diǎn)的形成，芽點(diǎn)經(jīng)進(jìn)一步生長(zhǎng)形成不定芽(圖1：b)，且形成率達(dá)到80. 00%以上。每塊愈傷組織上形成不定芽的個(gè)數(shù)不等，25 d時(shí)統(tǒng)計(jì)不定芽的平均增殖倍數(shù)約為8(圖1：c)。待不定芽長(zhǎng)至2～3 cm高時(shí)將其切下，轉(zhuǎn)入1/2MS附加NAA l.0 mg.L。1的培養(yǎng)基中，3d左右即可生根(圖1：d)，生根率為100%。待根長(zhǎng)至4—5 cm長(zhǎng)時(shí)(圖1：e)，可以進(jìn)行移栽。

　　2.4再生植株的倍性鑒定

　　從再生植株的形態(tài)和生長(zhǎng)情況來(lái)看，經(jīng)花藥培養(yǎng)獲得的單倍體植株較為弱小，且生長(zhǎng)較慢;而二倍體植株形態(tài)正常，生長(zhǎng)旺盛，在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。分別取對(duì)照和經(jīng)花藥培養(yǎng)所得植株的葉邊緣進(jìn)行染色體制片并計(jì)數(shù)，對(duì)其進(jìn)行染色體倍性鑒定。從圖l:f，g可以看出，經(jīng)花藥培養(yǎng)所得植株的染色體(n=7) 明顯減少，為正常二倍體植株(2n= 14)的一半;而同一植株中部分細(xì)胞的染色體數(shù)目還存在9條、10條、13條等情況，說(shuō)明在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中產(chǎn)生了一定數(shù)量的非整倍體。因此，對(duì)于菘藍(lán)單倍體植株的選育仍有待進(jìn)一步研究。

　　3討論

　　低溫處理可以有效地改變小孢子的配子體發(fā)育途徑，啟動(dòng)孢子體發(fā)育途徑，顯著提高小孢子愈傷組織或胚狀體的發(fā)生頻率;在一定程度上延緩小孢子退化，提早雄核發(fā)育，增加參與雄核發(fā)育的小孢子的比率(Li等，2008)。不同植物花藥低溫預(yù)處理的時(shí)間不同，溫度條件也存在差異。菘藍(lán)花藥培養(yǎng)的過(guò)程中，適宜的低溫預(yù)處理能夠提高愈傷組織誘導(dǎo)率，并縮短愈傷組織形成時(shí)間;但隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)率會(huì)隨之下降。在本研究中，低溫預(yù)處理2d可以提高菘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)率。

　　研究結(jié)果表明，菘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的適宜條件為MS口6-BA 0.5 mg -L。1和NAA l.0 mg -L。1，其誘導(dǎo)率為23.35%。與正常二倍體菘藍(lán)葉片和葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果(葉片和葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為97. 50%和80. 00%，苗永美等，2008)相比，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率偏低。這可能與花藥較高的分化水平、不同材料基因型的差異、以及培養(yǎng)條件等都有一定的關(guān)系。大多數(shù)禾本科植物，如水稻(李大林，2000)、小麥(裴翠娟等，1992)、大麥(魏凌基等，1995)等的花藥培養(yǎng)中，2，4-D是啟動(dòng)小孢子細(xì)胞形成愈傷組織的必要條件。而菘藍(lán)花藥培養(yǎng)過(guò)程中2，4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)表現(xiàn)出一定的抑制效應(yīng)，這與大多數(shù)植物花藥培養(yǎng)的研究結(jié)果不同，這種抑制效應(yīng)的機(jī)制如何，尚有待于從物質(zhì)代謝、激素水平和酶活性等方面進(jìn)行較為深入地探討。

　　迄今為止，未見(jiàn)有菘藍(lán)花藥培養(yǎng)及單倍體誘導(dǎo)的研究報(bào)道，本文從菘藍(lán)花藥低溫預(yù)處理、激素組合等方面進(jìn)行了研究，希望能為菘藍(lán)的花藥培養(yǎng)、單倍體誘導(dǎo)及育種等提供一定的研究依據(jù)。