探討菘藍花藥處于單核晚期的形態指標，并以適宜發育時期的花藥為外植體，進行花藥培養及單倍體誘導。實驗結果表明，4℃低溫處理2 d后，在含有6-BA 0.5 mg- L-I和NAA l.0 mg.L-1的MS培養基上，花藥愈傷組織的誘導率為23. 35%;將其轉接到MS附加6-BA l.0 mg- L-l，NAA 0.5 mg.L-I的分化培養基上，80. 00%以上的愈傷組織可以誘導產生不定芽;再將分化出的試管苗轉接到1/2MS+NAA1.0 mg.L-l的生根培養基上，3d左右即可獲得完整植株。經葉邊緣壓片檢查染色體數目，花藥培養所得的弱小綠苗為單倍體植株。

　　推薦期刊：　《植物科學學報》(雙月刊)創刊于1983年，為科學出版社出版的植物學綜合性學術期刊(學報級)，國內外公開發行。本刊宗旨：促進學術交流，推動學科發展，為國民經濟建設服務。獲獎情況：1989年，《武漢植物學研究》被湖北省科委、湖北省科協、湖北省新聞出版局、湖北省科學技術期刊編輯學會評為“湖北省優秀科技期刊”。1992年，被中共湖北省委宣傳部、湖北省科委、湖北省新聞出版局評為“湖北省優秀科技期刊”。、1995年，被中共湖北省委宣傳部、湖北省新聞出版局、湖北省科委授予“1994-1995年度湖北省優秀期刊”稱號，并被評定為一級期刊。

　　關鍵詞：菘藍;花藥培養;單倍體

　　菘藍(Isatis indigotica Fort.)為十字花科( Cruciferae)菘藍屬(Isatis)二年生草本植物，其根(板藍根)和葉(大青葉)均可入藥，是2010版《中國藥典(一部)》收錄的常用中藥品種，原產我國，全國各地均有栽培。菘藍具有清熱解毒、涼血消斑、利咽止痛之功效，含有靛藍、靛玉紅、有機酸、多糖等多種有效成分，廣泛用于治療流感、腮腺炎、乙腦、肝炎等多種疾病，其多糖組分具有一定的免疫調節和降血脂作用，而靛玉紅對治療慢性粒細胞白血病有較好的作用(劉海利，2002)。

　　單倍體育種過程中，植株經染色體加倍后，在一個世代中即可出現純合二倍體，其性狀不分離，表型整齊一致，育種年限顯著縮短。由于沒有顯性基因的掩蓋，隱性基因控制的性狀容易顯現，這對誘變育種和遺傳突變研究具有較大的優勢。我國應用單倍體育種技術先后育成了煙草、水稻、小麥等多個優良品種。目前，關于菘藍組織培養及植株再生體系建立的文獻較多(涂玉琴等，2009;張菊紅等，2006;張勝珍等，2009;汪洪等，2008)，但有關菘藍花藥培養及單倍體誘導的研究尚未見報道。本實驗以菘藍花藥為試材，研究花藥培養及植株再生的適宜條件，以期為菘藍單倍體育種提供一定的研究基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1材料

　　2009年4-5月間，隨機抽取種植于本校試驗田二年生的菘藍花藥為實驗材料。

　　1.2方法

　　1.2.1小孢子發育時期的檢測取材當日7：00-10: 00摘取生長健壯、無病蟲害、直徑不同、閉合的菘藍花蕾，同時觀察記錄花蕾特征和花藥顏色;將花藥置于卡諾固定液中處理24 h后，用改良苯酚試劑染色，壓片鏡檢花粉小孢子的發育時期。

　　1.2.2花藥的預處理與培養將花蕾置于4℃冰箱，分別進行0、2、4、8和12 d的預處理。接種前，將花蕾用流水沖洗1—2h，常規消毒后用濾紙吸干表面水分，小心剝取花藥，并接種于不同的培養基中進行培養。觀察并記錄愈傷組織誘導、不定芽分化與增殖、植株再生等情況。

　　1.2.3培養條件培養用基本培養基為MS，附加瓊脂6.5 g -L“，蔗糖30g-L“，滅菌后pH值為5.8左右。培養室溫度為(25土2)℃，光照強度為2 000~3 000ymol.m-2.s。1，每天光照12—14 h。1.2.4再生植株的倍性鑒定將試管苗葉片于流水中沖洗10 min，再用蒸餾水沖洗3次;切取葉邊緣組織，并用0.002 mol.1-1 8一羥基喹啉預處理2h，于卡諾固定液中固定24 h;轉入1 mol.L-l HCI中解離IO min，改良苯酚品紅試劑染色20 min，壓片、鏡檢染色體數目并拍照(段英姿等，2006)。同法取正常二倍體菘藍試管苗為對照，進行染色體制片并計數、拍照。

　　2結果與分析

　　2.1小孢子發育時期的鑒定

　　鏡檢結果表明，花蕾直徑小于0. 15 cm時，小孢子發育不成熟或處于單核早期，培養過程中，細胞分裂能力差，花藥存活力低;直徑大于0. 25 cm時，花蕾逐漸展開，花冠黃色，小孢子已發育至雙核至三核期，不宜作為花藥培養的外植體;而直徑在0.15 N0. 25 cm之間的閉合花蕾，花冠呈淡綠色至淡黃色，50%以上的小孢子處于單核中期至后期(靠邊期)。因此，菘藍花藥培養時，宜在取材當日選取健康、無病蟲害，花冠顏色為淡綠至淡黃色，直徑0. 15~0.25 cm、閉合花蕾中的花藥作為單倍體誘導的適宜外植體。

　　2.2花藥愈傷組織的誘導

　　2.2.1不同激素組合對花藥愈傷組織誘導的影響 接種一周左右，部分花藥開始膨大、縱裂并伴有愈傷組織的形成。隨著培養時間的延長，整個花藥完全脫分化成黃綠色、疏松的愈傷組織(圖l：a)，并最終轉為綠色、結構致密的愈傷組織(圖1：b)，不同激素組合對愈傷組織誘導的影響作用如表1所示。

　　從表1可以看出，花藥在MS附加6-BA 0.5mg.L-I和NAA l.0 mg.L-l的培養基中，經過6d的培養即可誘導愈傷組織形成，誘導率為20. 35 010;而添加了2，4-D的培養基組合中愈傷組織的誘導率分別在9. 30%到15. 00%之間不等。同時，添加2，4-D后愈傷組織的形成時間明顯推遲至10 d以上，推測2，4-D對菘藍花藥愈傷組織的形成具有一定的抑制作用。因此，適宜菘藍花藥愈傷組織誘導的培養基為MS附加6一BA O.5 mg. L-1和NAA l.0 mg.L。2.2.2不同低溫預處理對花藥愈傷組織誘導的影響與對照組相比，適當的低溫預處理能夠在一定程度上提高愈傷組織誘導率，同時縮短愈傷組織的形成時間。如2 d( 23. 35%)和4d( 18. 57%)的低溫預處理均較對照(15.26%)明顯地提高了愈傷組織誘導率。在相同的培養基中，與2.2.1項的結果(20.35%)相比，2 d的低溫預處理(23.35%)可以進一步提高愈傷組織誘導率;而較長的低溫預處理時間會在一定程度上降低愈傷組織誘導率，并延長其形成時間。因此，適宜菘藍愈傷組織誘導的低溫預處理時間為2 d。觀察結果表明，花藥培養一段時間后，藥隔處首先開裂，進而形成淡黃色的愈傷組織(圖1：a)。培養初期愈傷組織生長緩慢，隨后逐漸加快，7d左右愈傷組織塊直徑可達1.5 cm以上，顏色由淡黃轉為淡綠，質地由疏松轉為致密(圖1：b)。

　　2.3花藥愈傷組織的增殖、分化及完整植株的獲得

　　將花藥愈傷組織接種到MS附加6- BA1.0 mg.L-I和NAA 2.0 mg.L-l的培養基中，經過25 d左右的培養，愈傷組織旺盛生長并明顯增殖。2—3次繼代培養后，將其轉入MS附加6-BA1.0 mg.L-I，NAA 0.5 mg.L-1的培養基中，6d左右可以見到綠色芽點的形成，芽點經進一步生長形成不定芽(圖1：b)，且形成率達到80. 00%以上。每塊愈傷組織上形成不定芽的個數不等，25 d時統計不定芽的平均增殖倍數約為8(圖1：c)。待不定芽長至2～3 cm高時將其切下，轉入1/2MS附加NAA l.0 mg.L。1的培養基中，3d左右即可生根(圖1：d)，生根率為100%。待根長至4—5 cm長時(圖1：e)，可以進行移栽。

　　2.4再生植株的倍性鑒定

　　從再生植株的形態和生長情況來看，經花藥培養獲得的單倍體植株較為弱小，且生長較慢;而二倍體植株形態正常，生長旺盛，在培養基中呈現優勢生長。分別取對照和經花藥培養所得植株的葉邊緣進行染色體制片并計數，對其進行染色體倍性鑒定。從圖l:f，g可以看出，經花藥培養所得植株的染色體(n=7) 明顯減少，為正常二倍體植株(2n= 14)的一半;而同一植株中部分細胞的染色體數目還存在9條、10條、13條等情況，說明在愈傷組織誘導過程中產生了一定數量的非整倍體。因此，對于菘藍單倍體植株的選育仍有待進一步研究。

　　3討論

　　低溫處理可以有效地改變小孢子的配子體發育途徑，啟動孢子體發育途徑，顯著提高小孢子愈傷組織或胚狀體的發生頻率;在一定程度上延緩小孢子退化，提早雄核發育，增加參與雄核發育的小孢子的比率(Li等，2008)。不同植物花藥低溫預處理的時間不同，溫度條件也存在差異。菘藍花藥培養的過程中，適宜的低溫預處理能夠提高愈傷組織誘導率，并縮短愈傷組織形成時間;但隨著預處理時間的延長，誘導率會隨之下降。在本研究中，低溫預處理2d可以提高菘藍花藥愈傷組織誘導率。

　　研究結果表明，菘藍花藥愈傷組織誘導的適宜條件為MS口6-BA 0.5 mg -L。1和NAA l.0 mg -L。1，其誘導率為23.35%。與正常二倍體菘藍葉片和葉柄的愈傷組織誘導結果(葉片和葉柄的愈傷組織誘導率分別為97. 50%和80. 00%，苗永美等，2008)相比，花藥愈傷組織誘導率偏低。這可能與花藥較高的分化水平、不同材料基因型的差異、以及培養條件等都有一定的關系。大多數禾本科植物，如水稻(李大林，2000)、小麥(裴翠娟等，1992)、大麥(魏凌基等，1995)等的花藥培養中，2，4-D是啟動小孢子細胞形成愈傷組織的必要條件。而菘藍花藥培養過程中2，4-D對愈傷組織的誘導表現出一定的抑制效應，這與大多數植物花藥培養的研究結果不同，這種抑制效應的機制如何，尚有待于從物質代謝、激素水平和酶活性等方面進行較為深入地探討。

　　迄今為止，未見有菘藍花藥培養及單倍體誘導的研究報道，本文從菘藍花藥低溫預處理、激素組合等方面進行了研究，希望能為菘藍的花藥培養、單倍體誘導及育種等提供一定的研究依據。